1901年10月，陈独秀首次留学日本，进东京弘文学院师范科学日语。1902年3月返回，组织青年励志社。9月，陈独秀再次赴日，读东京成城学校陆军科。陈独秀在日本受到西方社会主义思想的影响。1903年3月31日夜，陈独秀、张继、邹容3人强行剪去湖北陆军学生监督姚昱的辫子，因而被遣送回国。
陈独秀回到安庆后，1903年5月17日在藏书楼发表拒俄演说，创办安徽爱国会。当公家开始镇压时，陈独秀逃往上海，和章士钊、谢晓石、张继等人出版《国民日日报》，社址设在新闸新马路梅初里。同年12月1日，上海地方政府禁止出售国民日日报。此后，他回到安庆。

1904年3月31日，陈独秀和房秩五、吴守一创办白话文《安徽俗话报》，“让安徽人通达时事，长点见识”。他担任所有编辑和发行工作。报纸在不到半年的时间内发行量从1000份增加到3000份，成为最受欢迎的白话文报纸之一。这份报纸从1904年到1905年共出刊23期，每期有40页，大约15000字。自第16版以后，该报又增加了16个话题，包括军事、中国哲学、卫生学、天文学等。这些增加的话题几乎都是他自己所写，他使用三爱这个笔名，至少发表了50篇文章。后来由于受到政治压力而停刊。

1905年秋，执教芜湖皖江中学，在芜湖发起成立反清组织“岳王会”并任总会会长。1907年春，陈独秀第三次留学日本，入东京正则英语学校学习，后入早稻田大学学习法国等西欧文化。
1908年陈独秀从日本回国，在杭州浙江陆军小学任国文史地教习。1911年，辛亥革命爆发，陈独秀应邀回乡任安徽都督府秘书长和安徽高等学堂教务主任。

1913年，陈独秀追随柏文蔚参加反袁项城“二次革命”，在芜湖一度遭龚振鹏逮捕，后获释。
1914年春，反袁运动失败后，陈独秀再度赴日本，协助章士钊办《甲寅》杂志。第一次使用笔名“独秀”发表文章《爱国心与自觉心》一文，开宗明义提出“人民何故必建设国家？其目的在保障权利，共谋幸福，斯成立国家之精神。”文中指出，要有爱国心也要有自觉心，“恶国家甚于无国家”，如果是一个人民在其中没有权利，无幸福可言的国家，“瓜分之局，何法可逃，亡国之奴，何事可怖”，引起舆论哗然，不少人指责其不爱国。
1915年夏，陈独秀回到上海，住法租界嵩山路吉谊里21号。9月15日创办月刊青年杂志（由群益书社发行），次年更名为《新青年》（副题La Jeunesse），自任总编辑。（1926年停刊）陈独秀在这份杂志的创刊号上发表《敬告青年》，提出6个原则：自主的而非奴隶的、进步的而非保守的、进取的而非退隐的、世界的而非锁国的、实利的而非虚文的、科学的而非想像的。

宣传倡导“德先生”（指“民主”Democracy）和“赛先生”（指“科学”Science），批判儒教和传统道德，“打倒孔家店”，因而成为新文化运动的中心，在青年人中影响很大。

陈独秀在1917年二月号的《新青年》杂志2卷6号发表《文学革命论》，认为中国社会黑暗的根源是“盘踞吾人精神界根深底固之伦理、道德、文学、艺术诸端”，单独的政治革命不能生效，“充分以鲜血洗净旧污”，需要先进行伦理道德革命，于是提出“三大主义”：“推倒雕琢的阿谀的贵族文学，建设平易的抒情的国民文学；推倒陈腐的铺张的古典文学，建设新鲜的立诚的写实文学；推倒迂晦的艰涩的山林文学，建设明了的通俗的社会文学。”主张改文言文为白话文，文章内容也要趋向实际。

1917年1月，蔡元培就任北京大学校长，聘任为北京大学文科学长并教授文学。得到北京大学校长的批准，他收集李大钊、胡适、鲁迅和钱沅的作品。为了扩大编辑部，他将《新青年》迁到北京。

1918年11月27日，陈独秀和李大钊合办《每周评论》杂志。

在蔡元培担任校长之前，北京大学的学生是八大胡同的常客。蔡元培担任校长后，致力改变这种风气。但陈独秀却依然流连在妓院之中。蔡元培起初还在报章上写文支持陈独秀，但后来迫于压力，在1919年3月26日深夜的一次会议商议后，决定废除北大的学长制，间接去除陈独秀的校务职位并放他一年假期，陈因此在事实上离开北大。多年后，参会的胡适与汤尔和曾争论3月26日的那次会议的结果造成的影响。

1919年，五四运动爆发后，6月8日，陈独秀在《每周评论》发表《研究室与监狱》，提出入监狱和入研究室，是青年人生最高尚最优美的生活。6月11日，陈独秀在城南新世界游艺场散发《北京市民宣言》被捕。9月16日保释出狱。